柱色谱技术的理论核心原理

牧芮安

       图5-2 液相色谱的分离度
　　  （5-1）式5-1给出了一个衡量分离好坏的尺度，但它并没有告诉我们如何获得一个较好的分离。为了搞清这个问题，我们将分离度表示为含有3个色谱分离参数的函数，这三个参数分别为柱效、选择性系数和保留特性，这些参数与固定相和流动相性质有关，与分离度R的关系如式5-2。 (5-2)式中 —— 表示柱效；——表示选择性；——表示保留特性。分离初始，在零时间，样品位于色谱柱的顶端。被分析的样品随流动相进入固定相，样品组分基于对两相亲和力的不同而被分离。一般地讲，固定相与流动相之间化学性质的差别应该足够大，被分析物才能与其中一相发生较强作用。正是由于保留时间的不同，使得分离得已实现。2 柱效柱效是指色谱柱保留某一化合物而不使其扩散的能力，柱效能是一支色谱柱得到窄谱带和改善分离的相对能力。我们可以通过一根柱子的理论塔板数来衡量色谱柱的柱效，在色谱柱中，理论塔板数N定义为： 图5-3 理论塔板数示意图
　　  （5-3）式（5-3）中，T是色谱峰中心与进样起始点间的距离，W1/2是峰高一半处峰的宽度（见图5-3）。理论塔板是指固定相和流动相之间平衡的理论状态。在一个塔板的平衡完成之后，分析物进入下一个平衡塔板，这种传送过程重复不断，直到分离。分子根据自身的性质（分子大小和电荷）进行转移或迁移，基于它们对固定相和流动相的亲和力的不同进行分离。分子移动并形成一条带状，以正态分布（高斯）的色谱峰流出。理论塔板数可以用于衡量整个色谱系统谱带的扩散程度。谱带扩散程度越小（即色谱峰越窄），理论塔板数N越大。理论塔板数N与色谱柱长度成比例；也就是说，色谱柱越长，理论塔板数N 越大。理论塔板高度（HETP）是单位长度色谱柱效能的量度，可用于比较不同长度的色谱柱的理论塔板数N。 （5-4）式中 L——为色谱柱的长度。式（5-4）表明高效率的色谱柱具有较大的理论塔板数。也就是说，具有较小的理论塔板高度。影响理论塔板高度的因素有：多流路，纵向扩散，传质影响。3 选择性系数选择性系数α是交换过程的一个热力学函数。色谱柱的选择性是两个化合物的调整保留时间的比值，也等于两个化合物在固定相和流动相之间平衡常数的比值，见图5-4及式（5-5）。 图5-4 色谱柱的选择性示意图
　　  （5-5）式中T2和T1是两峰峰中心与进样点的时间差值，T0是死体积保留时间。当保留时间的比值等于1时，没有任何分离度或称共洗脱。选择性越好或比值越大，对于两个化合物的分离越容易。公式中相对较小的改变，就会使分离度发生较大的改变。较高选择性可以在柱效相对较低的柱子上得到较好的分离。一般来说，流速和柱压的改变，对选择性没有影响。4 保留特性用容量因子k描述化合物保留特性，其定义如式5-6： （5-6）式中，T是色谱峰到进样起始时间点的差值，T0是死体积保留时间。本质上，容量因子k给出了分析物在固定相的时间超过在流动相中时间的数量。k值小说明化合物被柱子保留弱，化合物洗脱体积与死体积相近。k值大的说明被分析物与固定相作用较强而具有好的分离，但是较大的k值导致较长的分析时间和色谱峰的展宽。一般来说，k的*佳范围在2～10之间；可以通过改变流动相来获得*佳的k值。5 传质影响传质影响是描述由于柱子装填不均，造成流路分叉而引起的扩散。分析物在色谱柱中的流路受到柱子装填和树脂等许多因素的影响。填料颗粒的直径直接影响柱效。一般来说，粒径越小，分离效率越高。同时，颗粒大小和装填的均匀度越好，柱效也越高。如果一根柱子由大小不均匀的颗粒填充，溶质分子将由于相遇颗粒粒径大小的不同而以不同速度移动。这样造成溶质分子的流出谱带变宽。在一些装填不均匀的柱子中，溶质分子经过一些未填满的空隙或溶质分子或与树脂颗粒的相互作用将导致谱带扩散。因此，提高颗粒的均匀度和减小粒径可以减小谱带的扩散。6 纵向扩散用于描述任何气体和液体扩散或分散的内在趋势。这种情况可以发生在整个色谱系统中的任何地方。*初，在窄的谱带中的溶质分子向周围的溶剂扩散，使谱带变宽。理论上讲，纵向扩散也可以在流动相和在固定相中发生。结果表明，扩散问题在离子色谱填充柱中并不象在气相色谱中那样普遍。7 溶质传递动力学是描述溶质分子在固定相和流动相之间运动的速率。理想状态下，与填充柱作用的溶质分子不断出入固定相中。当分子在固定相中时，分子被保留而位于谱带的后面。当分子在流动相中时，由于液体流动速率总是大于谱带的速率，则它的速率总是大于谱带中心的速率。这种在两相之间的随意出入引起谱带扩散。如果不发生流动，溶质分子就会在两相之间达成平衡。正因为存在流动，在流动相中真实的溶质浓度无法与相邻的固定相中浓度达到平衡。色谱峰的扩散可以通过减小不平衡程度和增加交换速率来降低。溶质传递的动力学经常是谱带扩散的主要原因，因此对柱效的影响也是*大的。8 小结式（5-2）显示出分离度是一个与柱效、选择性、保留特性有关的函数。利用这些参数可以获得一个较好的分离度。其中每一项都可以用于改善分离效果。当建立一个方法时，柱子的选择性系数是十分重要的，因为它对分离的影响是*大的。增加分离系数α，使(α－1)/α增大，从而提高分离度。提高柱效，将增大，分离得到改善。柱效与柱性能有关还与流速有关，流速越慢，柱效越高。这是由于流动相中的被分析物可以有更多的时间与固定相作用，但这样会导致峰形的扩散。作为容量因子的一个函数，保留特性是确定柱子的状态*有用的参数，因此需要适当清洗柱子以恢复其保留特性。增加容量因子k，使增大，R随之增大。

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