鸭肝炎病毒抗体（DHV-Ab）ELISA实验说明

裴海碧

       检测范围  
　　1.5 ng/L -60 ng/L
　　使用目的
　　本试剂盒用于测定鸭血清血浆及相关液体样本中肝炎病毒抗体（DHV-Ab）含量。
　　实验原理
　　本试剂盒应用双抗原夹心法测定标本中鸭肝炎病毒抗体（DHV-Ab）水平。用纯化的抗原包被微孔板，制成固相抗原，往包被的微孔中依次加入肝炎病毒抗体（DHV-Ab），再与HRP标记的抗原结合，形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，经过彻-底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的肝炎病毒抗体（DHV-Ab）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中鸭肝炎病毒抗体（DHV-Ab）浓度。
　　标本要求
　　1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融
　　2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
　　操作步骤
　　1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
　　60 ng/L
　　5号标准品
　　150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液
　　30 ng/L
　　4号标准品
　　150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液
　　15 ng/L
　　3号标准品
　　150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液
　　7.5 ng/L
　　2号标准品
　　150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液
　　3.75 ng/L
　　1号标准品
　　150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液
　　2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
　　3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
　　4. 配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用
　　5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
　　6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
　　7. 温育：操作同3。
　　8. 洗涤：操作同5。
　　9. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟.
　　10. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
　　11. 测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。
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